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Genbanken durch Koloniehybridisierung identifiziert. Für beide Verfahren wurde die

Sonde I verwendet, die an das Gen sdmA bindet. Das Fragment für die Markierung

wurde mit den Oligonukleotiden p2sonde3´ und p2sonde5´ amplifiziert. Bei der

späteren Hybridisierung mit der Sonde betrug die Temperatur 55°C. Zunächst wurde

aber die Mindestzahl der zu untersuchenden Phagen berechnet. Aufgrund der Größe

des M. voltae-Genoms von 1900 kb (Sitzmann & Klein, 1991) ergab sich daraus eine

theoretische Anzahl von 1750 zu untersuchenden Phagen, wenn ein Gen mit einer

Wahrscheinlichkeit von 99 % gefunden werden sollte (Clarke & Carbon, 1976). Mit

den Phagen aus positiven Plaques der Southern-Hybridisierung wurden erneut XL1-

Blue MRF´-Zellen infiziert. Die Exzision der Plasmide erfolgte durch Koinfektion der

Zellen mit Hilfe eines Helferphagens, der den Replikationsstartpunkt f1 auf dem

Lambda ZAP II Vektor erkennt. Das ausgeschnittene Produkt ergibt ein pBluescript

SK (+/-) Phagemid, verpackt in die Phagenköpfe des Helferphagens. Diese wurden

nach Infektion des E. coli-Stammes SOLR

durch eine Plasmidpräparation erhalten.

Zur Kontrolle wurden sie über einen Dot-Blot verifiziert, wobei wieder die Sonde I

verwendet wurde. Als Negativkontrolle diente das Plasmid pBluescript ohne Insert,

das auf dem Dot-Blot kein Signal zeigte. Eine Wechselwirkung der Sonde mit der

Vektorsequenz war damit ausgeschlossen.

Für die Identifizierung des 5´- und 3´-Bereichs des Gens sdmA mittels der

Herstellung einer partiellen Plasmid-Genbank, wurde die genomische DNA mit

Eco RV behandelt. Eine Schnittstelle dieses Restriktionsenzyms befindet sich auch

in dem Gen sdmA (Abb. 5). Nach der Behandlung der chromosomalen DNA würde

man zwei Fragmente erwarten, die jeweils einen Teil des Gens sdmA tragen sollten.

Ihre Größen wurden durch eine Southern-Blot-Analyse mit der Sonde I

ermittelt (Abb. 6). Die Hybridisierungstemperatur betrug dabei 55°C. Das eine

Fragment hatte eine Größe von ca. 2 000 und das andere von ca. 1 200 bp. Die mit

Eco RV behandelte DNA wurde dann über ein 0,8 % Agarosegel aufgetrennt und die

Fragmente aus den Bereichen um 2 000 bzw. um 1 200 bp ausgeschnitten, eluiert

und zur Erstellung von zwei, den beiden Bereichen entsprechenden, partiellen

Genbanken verwendet. Nach der Koloniehybridisierung mit der Sonde I wurden

positive Klone aus beiden Genbanken isoliert und die Ergebnisse über einen Dot-Blot

verifiziert. Als Negativkontrolle diente der Vektor Topo pCR 2.1 mit einem bekannten

Insert, das mit Sonde I kein Hybrid bilden sollte. Die Negativkontrolle zeigte kein

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