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4 Material und Methoden

Hybridisierungsofen bei 90°C in 1 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 7 %SDS

inkubiert und anschließend einmal für 30 min bei 90°C mit 0,5 M Na-Phosphat-

Puffer, pH 7,2, 1% SDS gewaschen.

4.9.18.3 Dot-Blot

Dot-Blots wurden nach Ausubel et al. (1996) angefertigt. Dazu wurden 2 µl DNA-

Lösung aus einer Plasmidpräparation auf eine positiv geladene Nylonmembran

aufgetropft und die Membran für 5 min zur Denaturierung der DNA auf 1,5 M NaCl,

0,5 NaOH gelegt. Anschließend wurde die Nylonmembran mit 1,5 M NaCl,

0,5 M Tris/HCl, pH 8,0 gewaschen und die DNA durch UV-Strahlung (245 nm,

12 kJ/min, 2 min, UV Stratalinker 2400, Stratagene, Amsterdam, Niederlande) fixiert.

Anschließend konnte sie für eine Southern-Hybridisierung verwendet werden.

4.9.19 Präparation von RNA aus M. voltae

Die Präparation von RNA aus M. voltae erfolgte nach Chomczynski und Sacchi bzw.

nach Sambrook und Russell (1987 bzw. 2001) und nach Herstellerangaben (TRIzol

Reagents, Invitrogen, Karlsruhe). Dazu wurden 10 ml einer exponentiellen M. voltae

Kultur im Ethanol-Trockeneisbad schnell a/jointfilesconvert/481994/bgekühlt und anschließend bei 4000 x g

und 4°C für 20 min sedimentiert. Der Zellniederschlag wurde mit 1,6 ml Trizol lysiert

und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 320 µl Chloroform

wurde der Ansatz bei 13 000 x g und 4°C für 14 min zentrifugiert und die wässrige

Phase mit 800 µl Phenol, gepuffert mit 0,2 M Na-Acetat, pH 4,0, durchmischt. Nach

5 min wurden 320 µl Chloroform zugegeben und der Ansatz für 15 min bei 13 000 x g

und 4°C zentrifugiert. Aus der wässrige Phase wurde die RNA dann in beschriebener

Weise gefällt und in 20 µl mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltes H

aufgenommen.

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