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4 Material und Methoden

4.8 Mikrobiologische Methoden

4.8.1 Kultivierung von Methanococcus voltae

M. voltae wurde unter strikt anaeroben Bedingungen in einer H

/CO

Atmosphäre

(80/20) in definiertem Medium (Whitman et al., 1982) kultiviert. Dafür wurde

Natriumhydrogencarbonat dem Medium zu einer Konzentration von 36 mM und

Cystein zu 6,3 mM zugesetzt. Die Eisensulfatkonzentration wurde auf 14 µM erhöht.

Das Medium enthielt L-Aminosäuren zu folgenden Endkonzentrationen: 0,8 mM

Aspartat, 0,7 mM Asparagin, 0,7 mM Glutamin, 0,5 mM Glutamat, 0,7 mM Methionin,

0,8 mM Isoleucin, 0,8 mM, 0,9 mM Valin, 1,1 mM Alanin, 1,3 mM Glycin, 0,5 mM

Arginin, 0,6 mM Lysin, 1,0 mM Serin, 0,9 mM Threonin, 0,9 mM Prolin, 0,6 mM

Phenylalanin, 0,6 mM Tyrosin und 1,2 mM Tryptophan. Ferner wurden dem Medium

Vitamine zu nachfolgenden Konzentrationen zugefügt: 82 nM Biotin, 45 nM Folsäure,

486 nM Pyridoxin/HCl, 148 nM Thiamin/HCl, 133 nM Riboflavin, 406 nM

Nicotinsäure, 242 nM Liponsäure, 21 µM Na-D-Panthothenat und 4 nM Vitamin B12.

Anstelle von Selenat wurde dem Medium Selenit, wenn nicht anders angegeben, zu

einer Endkonzentration von 10 µM zugegeben. Bei Bedarf enthielt das Medium

DMSe (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), verdünnt in anaerobisiertem Methanol, zu einer

Konzentration von 10 µM. Puromycin wurde zu einer Endkonzentration 10 µg/ml

zugesetzt. Zur Erstellung von Wachstumskurven wurde M. voltae in 60 ml Medium in

1 l Serumflaschen kultiviert. Für gaschromatographische Messungen wurde auf

NaHCO

im Medium verzichtet. Statt dessen wurde es mit 5 mM Imidazol gepuffert

und auf pH 7 eingestellt. Festmedien wurden durch Zugabe von 1,3 % (w/v) Agar

(BD Difco

Bacto

Agar, BD Bioscience, Heidelberg) hergestellt.

4.8.2 Kultivierung von Escherichia coli

E. coli wurde auf Standard I-Medium (Merck, Darmstadt) nach Ausubel et al. (1996)

kultiviert. Bei Bedarf wurde dem Medium X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-

galactosid) zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml und Ampicilin zu 100 µg/ml

zugesetzt. Durch Zugabe von 1,5 % Agar wurden Festmedien hergestellt.

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