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4 Material und Methoden

4.9.5 Reinigung chromosomaler DNA aus M. voltae

Die Reinigung von chromosomaler DNA erfolgte nach Sitzmann und Klein (1991) mit

folgenden Veränderungen: Es wurden 10 ml Kultur bei 4 000 x g für 15 min

abzentrifugiert und der Zellniederschlag in 500 µl 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 10 mM

EDTA resuspendiert. Dem Ansatz wurde Ribonuklease A zu einer Endkonzentration

von 0,5 mg/ml zugegeben. Nach 45 min bei 37°C wurde das Gemisch zu 0,4 mg/ml

mit Proteinase K versetzt und dann für 3 h bei 55°C inkubiert. Proteine wurden durch

dreimalige Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt. Die DNA wurde danach gefällt

und anschließend in 200 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 , 1 mM EDTA aufgenommen.

4.9.6 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Plasmide wurden nach der Methode der alkalischen Lyse (Ausubel et al., 1996)

präpariert. Eine Extraktion mit Phenol/Chloroform folgte bei Bedarf, um eine höhere

Reinheit zu erhalten. Alternativ wurden Plasmidpräparationen über Anionentauscher

nach Angaben der Hersteller (Fastplasmid mini, Eppendorf, Hamburg bzw.

Nucleobond AX, Macherey-Nagel, Düren) durchgeführt.

4.9.7 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation von DNA wurde eine Polymerasekettenreaktion mit einer Taq-

Polymerase durchgeführt. Dazu wurden 1 pg – 1µg Matrize und je 50 pmol Primer in

einem Reaktionspuffer (PCR Mastermix, Eppendorf, Hamburg) zu einem

Endvolumen von 25 µl vermischt. Die Reaktionsbedingungen wurden nach

Sambrook und Russell (2001) gewählt. Die PCR-Produkte wurden mittels einer

Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, bei Bedarf eluiert und in Zielvektoren kloniert.

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