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4.7 Co-Expression und gemeinsame Reinigung von des-[225-246]-MtrA und

MtrH (MJMtrA3+MJMtrH) aus M. jannaschii

Die Co-Expression von des-[225-246]-MtrA und MtrH (MJMtrA3+MJMtrH) aus

M. jannaschii wurde in zwei Plasmide mit den die entprechenden Gensequenzen

tragenden E. coli BL21 (DE3)-Zellen durchgeführt (siehe Abschnitt 3.3.3). Hierzu

wurden zwei Plasmidkombinationen, zum einen MJmtrA3/pET22b+ und

MJmtrH/pACYC-Duet1, zum anderen MJmtrH/pET22b+ und MJmtrA3/pACYC-

Duet1, verwendet. Bei der ersten Variante wurden sowohl MJmtrA3 als auch MJMtrH

unlöslich in Einschlusskörperchen exprimiert. Bei der zweiten Kombination wurde

MJMtrH zwar ebenfalls in Einschlusskörperchen, MJMtrA3 jedoch in nur sehr

geringem Maße exprimiert, sodass diese Kombinationsmöglichkeit nicht weiter

verfolgt wurde (siehe Abbildung 4.14).

Nach dem Zellaufschluss durch Ultraschall und dem Abtrennen der

Einschlusskörperchen wurden diese mit 5 M Guanidinhydrochlorid solubilisiert. Die

Proteine wurden zunächst im entfalteten Zustand einer Gelfiltration auf Superdex 200

unterzogen, in den gesammelten Fraktionen durch Absoprtion bei 280 nm identifiziert

und vereinigt. Nach der Rückfaltung unter Zusatz von 0,5 % OG und 0,01 mM

Vitamin B

12a

im 100-fachen Volumen an Pufferlösung wurde erneut eine Gelfiltration

auf Superdex 200 durchgeführt. Die Fraktionen wurden mittels SDS-Page untersucht

(siehe Abschnitt 3.5.5).

Im Elutionsprofil der zweiten Gelfiltration waren sowohl höhermolekulare, auf

Aggregation der Proteine hindeutende, als auch nicht basisliniengetrennte Peaks im

mittleren und niedermolekularen Bereich zu sehen. Ein Peak der Absorptionskurve

bei 365 nm bei etwa 40 kDa zeigte bei der SDS-Page-Analyse zwar eine

Anreicherung von MJMtrA3, jedoch konnte kein gebundenes MJMtrH identifiziert

werden (siehe Abbildung 4.14). Auch eine Variation der Entfaltung bei 3-7 M

Guanidinhydrochlorid sowie unterschiedliche Bedingungen bei der Rückfaltung durch

10- bis 100-fache Verdünnung der Proteinprobe oder verschieden Detergenzien

(0,05-1 % LM, 0,5-1 % OG) ermöglichten keine gemeinsame Reinigung von

MJMtrA3 und MJMtrH.

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