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3 Methoden

280 nm als proteinhaltig identifizierten Fraktionen wurden vereinigt und mit einem

Konzentrator mit einem MWCO von 10 kDa auf ca. 250 µL eingeengt.

Die Rückfaltung von MtrH wurde initiiert, indem die Proteinlösung langsam und

unter Rühren bei RT in 25 mL Rückfaltungspuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0,

10 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,05 % LM) getropft wurde. Nach Rühren über Nacht bei

RT wurde ausgefallenes Protein abzentrifugiert (43 000 x g, 30 min, 4 °C), der

Überstand mittels eines Konzentrators mit 10 kDa-Membran auf 1 mL eingeengt und

durch eine 0,2 µm-Membran filtriert.

Das rückgefaltete MtrH wurde nochmals einer Gelfiltration auf Superdex 200

(Superdex 200 16/60 prep grade, CV: 120 mL) mit 1,2 CV Rückfaltungspuffer bei

4°C, Flussrate 0,5 mL/min unterzogen. Detektiert wurde bei 280 nm. MtrH

enthaltende Fraktionen wurden durch SDS-Page identifiziert.

3.5.4 Reinigung von rekombinantem des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus

M. jannaschii

Die wie in Abschnitt 3.3.3 beschrieben angezogenen E. coli-Zellen wurden in

7,5 mL Lysepuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,1 mM

Vitamin B

12a

) pro g Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert und mit 267 µg/mL

Lysozym und 67 µg/mL DNAse I 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde mittels

Ultraschallbehandlung (15 min, Puls: 50 %, Leistung: 5 W, 0°C) aufgeschlossen und

das Zelldebris durch Zentrifugation (43 000 x g, 30 min, 4 °C) entfernt. Weiterhin

wurden die Zellmembranen in einem Ultrazentrifugationsschritt (150 000 x g, 1 h,

4 °C) pelletiert.

Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde nun für 30 min auf 70 °C erhitzt und

anschließend über Nacht auf 4 °C gekühlt, bis alle denaturierten E. coli-Proteine

ausgefallen waren. Diese wurden durch Ultrazentrifugation entfernt (150 000 x g, 1 h,

4 °C).

Zur weiteren Reinigung wurde der Überstand durch eine 0,45 µm-Membran

filtriert und auf einer mit Puffer A (50 mM MOPS/KOH pH 7,0) äquilibrierten

Q-Sepharose-Säule (HiLoad™ 26/10 Q-Sepharose HP, CV: 53 mL) einer

Ionenaustauschchromatographie bei RT unterzogen. Zur Elution wurde ein Gradient

von 0-100 % Puffer B (50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 1 M NaCl) über 7 CV bei einer

Flussrate von verwendet. Detektiert wurde mittels Absorptionsmessung bei 280 nm

und 365 nm (Absorptionsmaximum von Vitamin B

12a

). Die laut SDS-Page MJMtrA3

enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.

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